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                            初代細胞培養——消化培養法

                            發布時間: 2021-11-08  點擊次數: 1891次
                            材料與儀器

                            組織
                            Hanks 培養液 胰蛋白酶
                            吸管 平皿 培養瓶 燒杯 攪拌器 三角燒瓶 不銹鋼篩 眼科剪 眼科鑷 計數板

                            實驗步驟

                            1.  準備

                            取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面,紫外線消毒20 分鐘;


                            2.  布局

                            點燃酒精燈(或煤氣燈),安裝吸管帽(應通過火焰);

                            3.  處理組織

                            把組織塊置入燒杯中,用Hanks液漂洗2~3 次,去除血污;如懷疑組織可能污染,可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘;

                            4.  剪切

                            用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊(用手術刀割亦可),以便于消化;加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角燒瓶中,結扎瓶口或塞以膠塞;

                            5.  消化

                            或用恒溫水浴,或置入37 ℃溫箱消化均可,消化中每隔20 分鐘應搖動一次,如用電磁恒溫攪拌器消化更好(消化前瓶中需置一無菌攪棒);消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定;

                            6.  分離

                            在消化過程中見消化液發混濁時,可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察,如組織已分散成細胞團或單個細胞,立即終止消化,隨即通過適宜不銹鋼篩,濾掉尚未充分消化開的組織塊(必要時可繼續進行消化);低速(500~1000 轉/分)離心消化液5 分鐘,吸出上清,加入適量含有血清的培養液(如有其它酶或EDTA 等消化,需用Hanks液洗脫一兩次后,再加入培養液);

                            7.  計數

                            用計數板計數,如細胞懸液細胞密度過大,再補加培養液調整后,分裝入培養瓶中;對大多數細胞來說,pH 要求在7.2~7.4范圍,培養液呈微紅色,如顏色偏黃,說膽液體變酸,可用NaHCO3調整;

                            8.  培養

                            置入36.5 ℃溫箱培養;如用CO2溫箱培養,瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞,紗布塞易生霉菌,每次換液時需更換新塞。



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