銷售熱線

                          19126518388
                          • 技術文章ARTICLE

                            您當前的位置:首頁 > 技術文章 > 如何從培養細胞中制備細胞核基質/中間纖維骨架結構?

                            如何從培養細胞中制備細胞核基質/中間纖維骨架結構?

                            發布時間: 2021-11-18  點擊次數: 1339次

                            材料與儀器

                            細胞
                            Tritron X-100 抽提緩沖液
                            電子顯微鏡

                            步驟

                            1. 在 4℃ 用 PBS 洗細胞一次。

                            2. 在 4℃ 用含 0.5% Tritron X-100 的細胞骨架緩沖液抽提細胞 3 到 5 分鐘。直到消化步驟,每 107 個細胞最少要用 1 ml 緩沖液,以后減半。

                            3. 在 4℃ 用抽提緩沖液抽提細胞 3~5 分鐘。這一步去除組蛋白 H1 和除中間纖維蛋白之外的細胞骨架蛋白。另外,這一步也可在 DNA 酶消化步驟(第 4 步)之后作,這樣也不會引起超微結構的變化。

                            抽提緩沖液:

                            10 mmol/L PIPES,pH 6.8

                            250 mmol/L 硫酸銨

                            300 mmol/L 蔗糖

                            3 mmol/L MgCl2

                            1 mmol/L EDTA

                            4. 在含 0.5% Triton X-100 的消化緩沖液中用無 RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色質 DNA 酶濃度為 200~400 單位/ml,32℃ 反應 30~50 分鐘。

                            含 0.5% Triton X-100 的消化緩沖液:

                            10 mmol/L PIPES,pH 6.8

                            300 mmol/L 蔗糖

                            50 mmol/L NaCl

                            3 mmol/L MgCl2

                            1 mmol/L EGTA

                            5. 用抽提緩沖液清洗樣品兩次,每次 5 分鐘。

                            6. (可選)樣品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分鐘。這一步能使可能形成核基質核心的 10 nm 纖絲分支顯形(Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ(每種酶 400 單位/ml)代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纖絲保存的更好。

                            2 mol/L NaCl 緩沖液:

                            10 mmol/L PIPES,pH 6.8

                            300 mmol/L 蔗糖

                            2 mol/L NaCl

                            3 mmol/L MgCl2

                            1 mmol/L EGTA

                            7. 固定核基質以進行免疫熒光檢測或電子顯微鏡檢測。


                          產品中心 Products
                          图片小说亚洲中文字幕|国产真人一级a爱做片无码|国产91最新欧美在线|国产日韩欧美综合