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                            備擇方案 1 對貼壁細胞

                            發布時間: 2022-03-10  點擊次數: 1317次

                            原理

                            材料與儀器

                            貼壁細胞 [35S]標記L-甲硫氨酸(>800 Ci/mmol)/[35S]標記蛋白質水解產物
                            PBS(冷凍) 37℃ 脈沖標記培養基
                            100 mm 組織培養皿 配有液體同位素垃圾閥門的真空吸氣器

                            步驟

                            1. 在 100 mm 組織培養皿中培養細胞到 80%~90% 融合(0.5 × 107~2 × 107 細胞,取決于細胞類型)。


                            2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體(見基本方案步驟 1)。


                            3. 吸棄上清并用 10 ml 預熱(37℃)脈沖標記培養基輕柔洗細胞 2 次,棄掉洗液。


                            4. 加 5 ml 預熱脈沖標記培養基,在潮濕、37℃、5% CO2 培養箱內孵育 15 min,以除去細胞內的甲硫氨酸。


                            5. 棄掉細胞上的培養基,加入 2 ml [35S] 甲硫氨酸的工作液體(見步驟 2),在 CO2 培養箱內孵育 10~30 min。


                            6. 棄掉細胞上的培養基。用 10 ml 冷凍的 PBS 洗細胞并棄掉 PBS。加 10 ml 冷凍的 PBS,并用塑料刮子或橡膠細胞刮小心刮取收集細胞。


                            7. 轉移懸液到 15 ml 離心管中,4℃,300 g 離心 5 min,棄上清。如果在標記過程中細胞明顯脫落,有必要將含有 [35S] 甲硫氨酸的工作液中的細胞小心刮取,并將懸液轉移到 15 ml 離心管中,在用 PBS 洗滌前離心。


                            8. 可選:通過 TCA 沉淀法測定標記摻入的量(見輔助方案)。

                            注意事項

                            如果在標記過程中細胞明顯脫落,有必要將含有[35S]甲硫氨酸的工作液中的細胞小心刮取, 并將懸液轉移到15 ml離心管中,在用PBS洗滌前離心。

                            常見問題

                            1. 實驗材料中貼壁細胞,如 HeLa、NRK、Ml、COS - 1、CV - 1,或原代培養的成纖維細胞或內皮細胞。

                            2. 如果細胞沉淀不馬上使用的話,見基本方案步驟7。

                            同實驗其他方法

                            氨基酸代謝標記實驗

                            1. 室溫融化 [35S] 標記甲硫氨酸,并用預熱的(37℃)脈沖標記培養基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min,獲得懸液中 0.5 × 107~

                            備擇方案 2 示蹤標記細胞

                            1. 每個時間點和每個樣品準備 0.5 × 107 ~2 × 107 細胞, 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標記

                            備擇方案 3 長期細胞標記

                            1. 在預熱的 37℃ 長期標記培養基中制備 0.02~0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液(見基本方案步驟 1)。2.1 對于懸浮細胞:用預熱的長期標記培養基準備并洗細胞一次

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