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                            輔助方案 TCA 沉淀測定標記摻入量

                            發布時間: 2022-03-10  點擊次數: 1488次

                            原理

                            材料與儀器

                            被標記的細胞懸液(見基本方案或備擇方案 1~4)
                            0.1%(m V)BSA/0.02%(m V)NaN3 10%TCA 溶液 冷凍乙醇
                            連接真空管道的濾過裝置 2.5 cm 玻璃微纖維濾膜(Whatman GF/C)

                            步驟

                            1. 加 10~20 μl 被標記的細胞懸液到 0.1 ml 0.1%(m/V)BSA/0.02%(m/V)NaN3 中,置于冰上。


                            2. 加 1 ml 冷凍的 10%(m/V)TCA 溶液。劇烈振蕩混勻,在冰上孵育 30 min。


                            3. 在真空濾過裝置內,濾過細胞懸液到 2.5 cm 玻璃微纖維濾膜上。


                            4. 用 5ml 冷凍 10%TCA 溶液洗膜 2 次,再用乙醇洗 2 次??諝飧稍?30 min。


                            5. 在玻璃微纖維濾膜上點同樣體積(見步驟 1,10~20 μl)的放射性標記的細胞懸液,在空氣中干燥。


                            6. 轉移濾膜到 20 ml 閃爍管里,加 5 ml 閃爍記數溶液,用閃爍記數儀測定放射活性。


                            7. 計算 TCA 沉淀標記(見步驟 4)與總放射活性的比值(見步驟 5)。

                            注意事項

                            1. TCA 有強烈腐蝕性。在制備和操作 TCA 溶液時注意保護眼睛并避免皮膚接觸。

                            2. 洗液應按照混合化學/放射性廢棄物處理。根據安全規程進行處理。

                            常見問題

                            同實驗其他方法

                            氨基酸代謝標記實驗

                            1. 室溫融化 [35S] 標記甲硫氨酸,并用預熱的(37℃)脈沖標記培養基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min,獲得懸液中 0.5 × 107~

                            備擇方案 1 對貼壁細胞

                            1. 在 100 mm 組織培養皿中培養細胞到 80%~90% 融合(0.5 × 107~2 × 107 細胞,取決于細胞類型)。2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體(見基本方案步驟 1

                            備擇方案 2 示蹤標記細胞

                            1. 每個時間點和每個樣品準備 0.5 × 107 ~2 × 107 細胞, 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標記

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