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                            部分分解多肽兩端有關的 PCR 法篩選 PK-120 基因實驗

                            發布時間: 2022-03-24  點擊次數: 1413次

                            材料與儀器


                            PK-120
                            Sephadex-50 Gene Amp RNA PCR 試劑盒 合成寡聚核苷酸 抽提液 酵母 tRNA
                            PCR 擴增儀


                            步驟


                            實驗所需「試劑」具體見「其他」


                            1. 引物設計


                            PK-120 部分分解多肽氨基酸序列中,最長序列 K-15,16 為引物設計的依據:

                            1.1 考慮全部編碼的組合,

                            1.2 考慮人編碼的使用頻率,設計 PCR 引物,正義鏈及反義鏈如用這些引物獲得的 PCR 產物當中,50 bp 的產物為目的 cDNA。


                            2. PCR 擴增


                            從肝臟來源的 poly(A)+ RNA 中,用 Gene Amp RNA PCR 試劑盒如以下所述,合成 cDNA 0.1ug 的 poly(A)+ RNA 中,加入 5 mmol/L MgCl2:

                            1×PCR 緩沖液Ⅱ,

                            2 mmol/L dNTPs,

                            1u 的 RNase inhibitor,

                            2.5 umol/L random hexamers

                            2.5 u 反轉錄酶,

                            混勻,總體積為 20 ul。


                            在 PCR 擴增儀上反應,PCR 參數為 :

                            25℃ 10 min,

                            42℃ 30 min,

                            99℃ 5 min,

                            25℃ 5 min ,

                            第 1 循環反應,合成 cDNA。

                            在反應液中再分別加終濃度為 2 mol/L MgCl2,1×PCR 緩沖液Ⅱ,加 1nmol 3' 引物 5' 引物?;旌?,總體積為 100 ul。

                            94℃ 3 min 1 循環。

                            94℃ 1 min,

                            37℃~42℃,2 min,

                            72℃, 2 min,

                            40 循環。

                            72℃, 7 min,1 循環。


                            3. 凝膠電泳及提取 DNA


                            純化 PCR 產物后,在 0.25×TBE 溶液中,進行 10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳,分子量標準使用限制性酶 Msp1 消化的質粒 pBR322。電泳結束后,凝膠經溴化乙錠染色,紫外照射,觀察到 50 bp 的 PCR 產物。將這 50 bp 的條帶切下,在抽提液中,室溫放置過夜之后 1200 r/min 4℃ 離心 10 min,回收上清。反復操作兩次,用乙醇沉淀 2 次,用 TE 液溶解,上樣 Sephadex-50 柱,再用乙醇沉淀洗脫組分,沉淀懸浮于 TE 溶液中。


                            4. 測定堿基序列


                            抽取提出的 PCR 產物用 PCRⅡ載體亞克隆,測定堿基序列。其結果以肝臟 poly mRNA 為模板,據引物 S15-i 和 A15-i 擴增的 50 bp 的 PCR 產物序列,和從氨基酸序列預測的堿基序列*一致。表明這是編碼母的部分分解多肽的 cDNA。


                            注意事項


                            常見問題


                            試劑:


                            Sephadex-50


                            Gene Amp RNA PCR 試劑盒


                            合成寡聚核苷酸用 BIO-SYNTHESIS,INC 公司產品合成寡聚核苷酸


                            抽提液


                            750 mmol/L 醋酸銨-10 mmol/L 醋酸鎂-0.1 mmol/L EDTA-0.1%SDS-1%TE 飽和酚


                            25ug/ml 酵母 tRNA


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