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                            瓊脂中克隆培養

                            發布時間: 2022-12-13  點擊次數: 1542次

                            原理

                            溫度高時瓊脂呈液態,但在37℃ 時成凝膠狀態,細胞懸浮在溫暖的瓊脂凝膠培養基中,待瓊脂形成凝膠后進行培養,形成散在集落,很容易分離。

                            材料與儀器

                            Noble瓊脂 Difco 胎牛血清
                            兩倍濃度培養基 生長培養基 無菌超純水 無菌錐形瓶 吸管 通用容器 培養皿 水浴 三角瓶 托盤 電子細胞計數儀 本生煤氣噴燈

                            步驟

                            1. 在培養皿底皿側面編號或做好標記,將培養皿放在托盤中,很方便。

                            2. 準備含 40 % FBS 的 2× 培養基(即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培養基配 2× 培養基,取半量所需終液量,加兩倍濃度的血清),保持 37℃。

                            3. 稱取 1.2 g 瓊脂。

                            4. 分別在無菌錐形瓶和另一個無菌瓶中加 100 ml 無菌 UPW。將 1.2 g 瓊脂放人錐形瓶中,蓋好,煮沸 2 min 。另一種方法是,提前高溫滅菌瓊脂。但若已保存起來,使用時仍需煮沸溶解或微波爐融化備用。

                            5. 將煮沸過的瓊脂和有 UPW 的瓶放到 55°C 水浴中。

                            6. 2× 培養基和 1.2 % 瓊脂等量混合制備 0.6 % 瓊脂底層,保持 37°C 。如果需要任何的生長因子、激素或其他添加物,應在此時添加至底層瓊脂培養基(生長培養基,1×,用于細胞稀釋)內。

                            7. 在培養皿中加人 1 ml 0.6 % 的瓊脂培養基,晃勻,確保培養基覆蓋整個培養皿底。置于室溫定型。

                            8. 制備細胞懸液,計數。

                            9. 準備 0.3% 瓊脂培養基,保持 37°C 。此培養基可以用 37°C 的 2× 培養基、55°C 的 1.2 % 瓊脂和 55°C 的 UPW 以 2:1:1 的比例混合制備。

                            10. 制備以下稀釋濃度的細胞,使細胞的最大濃度為 1×105 /ml。

                            (a)1×105 /ml

                            (b)將 1×105 /ml 稀釋 3 倍成 3.3×104 /ml

                            (c)將 3.3×104 /ml 稀釋 3 倍成 1.1×104 /ml

                            (d)將 1.1×104 /ml 稀釋 3 倍成 3.7×103 /ml

                            11. 將四種稀釋液的濃度分別標在 4 個小玻璃瓶或試管上,從每種稀釋液中吸出 40 μl,包括 1×105 /ml 細胞液,分別放入相應容器內 37°C 加 4 ml 0.3% 瓊脂培養基,混勻,再從每個容器(通用容器,小玻璃瓶或離心管,稀釋細胞用)中吸出 3 個 1 ml 分別加在相應的三個培養皿上。最終濃度如下:

                            (a)1×103 /ml/皿

                            (b)330 /ml/皿

                            (c)110 /ml/皿

                            (d)37 /ml/皿

                            加細胞之前, 確保上層瓊脂培養基有足夠的時間冷卻至 37°C 。

                            12. 待培養皿中的溶液在室溫下形成凝膠狀態。

                            13. 將培養皿放置在一個帶蓋的清潔塑料盒中,37°C 加濕溫箱中培養 10 天。

                            注意事項

                            準備培養基和細胞之前,先算出細胞稀釋度,在培養皿上做好標記,檢測一個細胞系的克隆形成率時,為每種稀釋度的細胞分別準備3 個培養皿。每個3. 5 cm 培養皿適宜接種的細胞數是1000、333、111和 37 個。也就是依次 3 倍的稀釋細胞懸液。如果需要加入生長因子、激素或其他添加劑,應加在下層的 0.6 % 瓊脂中。


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