實時熒光定量 PCR 操作流程及注意事項---FAQ

FAQ

總RNA提取-酚氯仿抽提法

RNA降解

組織樣本保存不當。RNA提取時需選擇新鮮組織或細胞樣本，若為凍存樣本，盡量避免反復凍融。樣品離開活體或原來的生長環境后，樣品中的內源 RNase開始降解 RNA，降解速度與內源 RNase 的含量及溫度有關。 也可將新鮮組織充分浸泡在 RNA Keeper Tissue Stabilizer (Vazyme #R501) 中，組織可于室溫存放一周，4℃存放一個月 或 -20℃ /-80℃長期保存。 投入樣本較多，導致裂解不充分。RNA保存時間過久，發生降解。對提取的 RNA 進行純度和完整度檢測，分管于 -80℃長期保存或于 -20℃短期保存，盡快使用，避免反復凍融。

提取的RNA有基因組污染

向裂解液中加入氯仿后，需要在低溫下 (2℃ -8℃ ) 高速離心。 離心后，RNA 被抽提到上層的水相中，中、下層為有機相，含有氯仿。DNA 即存在于中層。氯仿在常溫下會與水以一定的比例互溶，因此，常溫離心會導致上層水相中也有少量基因組 DNA 污染。另外，吸取上層液體時，應非常小心，避免吸到中間層和下層。

加入異丙醇離心后未看到沉淀

RNA 含量可能較低。建議加入異丙醇后于 4℃或 -20℃放置 10-30 min 后再次離心。若依然看不到沉淀，棄上清時，采用吸取而非傾倒的方法，以免沉淀丟失。

總RNA提取-柱式提取法

gDNA-Filter Columns 堵塞問題

（a）樣品用量太多

本試劑盒適用于提取 10-20 mg 動物組織或者 2-5×106 個細胞，超量的組織會降低產量以及純度，操作時應減少樣本使用量。

（b）樣品富含肌纖維

肌肉、心臟以及皮膚等富含肌纖維，肌纖維的分子量大，會引起柱子堵塞，樣本處理時采用液氮研磨方式會降低堵柱現象。

(c) 組織研磨或者勻漿不充分

研磨或者勻漿不充分時，碎片有可能導致柱堵塞，將裂解后的液體先進行 13,000 × g 離心 5 min，取上清再加入 gDNAFilter Columns。

提取不到RNA或者RNA產量低

（a）樣本保存不當或者樣本保存時間過久

樣本保存不當或者保存時間過長都有可能導致 RNA 的降解，采集新鮮樣本或經過液氮速凍后保存于 -70℃或液氮中的樣本。

(b)勻漿或者液氮研磨不充分

勻漿或者液氮研磨不充分，裂解不充分，導致 RNA 的釋放不充分。

(c)洗脫不充分

RNase-free ddH2O 滴加到純化柱膜中央。純化柱的洗脫體積為 50-200 μl，若洗脫效果不理想，可加入提前于 65℃預熱的 RNase-free ddH2O，延長室溫放置時間，離心后進行第二次洗脫。

RNA 降解

純化后的 RNA降解與樣本質量、是否被 RNase 污染、操作方式等因素有關：

（a）樣本因為沒有及時保存，導致 RNA 降解

組織樣本或者細胞在收集后若不及時進行后續實驗，液氮速凍后于 -70℃保存。

（b）樣本反復凍融

組織樣本保存時，分小塊保存，避免因反復凍融導致樣本降解。

（c）電泳原因

RNA 降解現象部分因電泳過程引起，電泳前將電泳槽用 3％雙氧水浸泡 20 min，之后用 RNase-free ddH2O 進行沖洗，電 泳緩沖液用 RNase-free ddH2O 配置。

(d)確保提取過程中使用的槍頭和離心管均為 RNase-free。

下游實驗結果不理想

（a）洗脫后 RNA 中有鹽離子殘留

純化柱需要進行兩次 Buffer RW2 洗滌，如果兩次洗滌后仍存在鹽離子殘留，則在加入 Buffer RW2 后，室溫放置 5 min 再 進行離心操作，以最高水準上去除鹽離子污染。

(b)洗脫后 RNA 有乙醇殘留

確認 Buffer RW2 洗滌后，按操作說明所需的離心轉速進行空管離心操作；如仍有乙醇殘留，可在空管離心后室溫放置  5 min，最高水準上去除殘留乙醇。

式抽提法

提取的RNA有基因組DNA污染

不同種類組織細胞 DNA、RNA 含量相差較大，樣本上樣量請勿超過 20 mg 組織和 5×106 細胞。如肝臟、脾臟和腎臟 DNA 含量豐富，上樣量請勿超過 10 mg，否則會導致基因組殘留過多。gDNA-Filter Columns 能夠有效去除體系中大部分 DNA，如果下游實驗對痕量 DNA 敏感，可根據具體情況選擇使用以下方案：

(a) 使用試劑盒提供的 DNase I 工作液進行膜上消化清除殘留 DNA，具體過程請參照實驗操作流程模塊。

(b)逆轉錄時選擇含有基因組去除模塊的逆轉錄試劑，推薦使用 HiScript®  III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)  (Vazyme #R323)。

(c)設計引物時選用跨內含子的引物，從而避免基因組 DNA 模板參與擴增反應。

逆轉錄反應

逆轉錄試劑盒中帶有gDNA wiper Mix，可以去除殘留在RNA中的基因組。但如果不進行基因組去除，會影響接下來的逆轉錄嗎？

不去除基因組并不會影響逆轉錄實驗的進行，但如果基因組殘留嚴重而未進行去除，會影響下游熒光定量實驗的準確性。

延長逆轉錄時間，是否可以提高逆轉錄效率？

對于一般體系，延長逆轉錄時間對逆轉錄效率并沒有顯著提升；對于一些 GC 含量較高或含高級結構的模板，延長逆轉錄 時間可提升逆轉錄效率。

熒光定量PCR

絕對定量標準曲線線性關系不佳

(a)加樣誤差

加大模板稀釋倍數，提高加樣體積。

(b)標準品降解

重新制備標準品，重復實驗。

(c)模板濃度過高

增加模板稀釋倍數。

在定量時，如何判斷cDNA投入量

第一次得到的 cDNA 需要進行多個梯度稀釋，將不同梯度稀釋的 cDNA 進行 qPCR 定量，選取 CT 值落在 18-28，或者 15-33 范圍內的擴增曲線對應的 cDNA 稀釋梯度作為后續該基因的參考稀釋度。(CT 值在 18-28，或者 15-33 區間范圍被認為是 準確的 )。

融解曲線多峰

（a）引物設計不優：根據設計原則設計合成新的引物。

（b）引物濃度太高：適當降低引物濃度。

（C）cDNA 模板帶有基因組污染：重新制備 cDNA 模板。

（d）CT 值≥ 30 易出現非特異擴增。

陰性對照出現明顯擴增

(a)反應體系污染

更換新的 Mix、水、引物重復實驗。反應體系在超凈工作臺內配制，減少氣溶膠污染。

(b)擴增為引物二聚體引起

配合融解曲線進行分析。

CT值出現太晚

(a)擴增效率極低

優化反應條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設計合成引物。

（b）模板濃度太低

減少稀釋度重復實驗，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

(c)模板降解

重新制備模板，重復實驗。

(d)PCR 產物太長

推薦 PCR 產物長度為 80 bp-150 bp。

（e）體系中存在 PCR 抑制劑

重新制備模板，重復實驗。

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熒光定量 PCR

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逆轉錄反應

總 RNA 提取 - 酚氯仿抽提法

總 RNA 提取 - 酚氯仿抽提法

總 RNA 提取 - 酚氯仿抽提法